ایمونوفنوتایپینگ جمعیت سلولی دندریتیک انسانی

فلوسایتومتری چند رنگ برای شناسایی و مشخص کردن جمعیت سلول های دندریتیک انسان در خون محیطی

سلول های دندریتیک (DCs) نقش مهمی در ایمنی ذاتی و اکتسابی دارند. آنها سلول های ارائه دهنده آنتی ژن هستند که سلول های بکر را آماده می کنند و پاسخ سلول های T خاطره به آنتی ژن های خارجی را برمی انگیزند. زیر مجموعه های DC را می توان به سه نوع طبقه بندی کرد. پلاسماسیتوئید (pDC)، میلوئید/معمولی (cDC1) و میلوئید/معمولی (cDC2) هستند.

ساختار فیلتر آنالایزر سلولی BD FACSymphony A3 انعطاف‌پذیری  برای تخصیص فلوئوروکروم‌ها در پنج لیزر ارائه می‌دهد که نه تنها تمایز زیرمجموعه‌های کلاسیک و غیرکلاسیک DC، بلکه زیر مجموعه‌های DC منحصربه‌فرد مانند Axl+ Siglec6+ DC (AS DC) وسلول دندریتیک (pDC) پلاسماسایتوئید را تسهیل می‌کند.

پروتکل

PBMC های تازه از خون کامل اهداکنندگان سالم  با سانتریفیوژ گرادیان  جدا شدند. با استفاده از یک کوکتل آنتی بادی  با حجم های آزمایش مشخص شده در هر معرف (جدول 1) تهیه شد. PBMC ها با کوکتل آنتی بادی به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق (RT) در تاریکی رنگ آمیزی شدند. کنترل های تک رنگ و فلورسانس منهای یک (FMO) به موازات پانل کامل پردازش شدند. پس از رنگ آمیزی، سلول ها سه بار با بافر رنگ آمیزی BD FACS™ شسته شدند و با استفاده از آنالایزر سلولی BD FACSymphony A3 خوانش شدند. داده ها با استفاده از نرم افزار FlowJo v10.7 مجدداً آنالیز شدند.

جدول 1.  کانفیگوریشن دستگاه و انتخاب ریجنت. مارکر های سطح سلول و کلون های آنتی بادی مورد استفاده در کوکتل برای پنل DC چند رنگ در جدول 1 نشان داده شده است. فلوئوروکروم ها بر اساس آنالایزر سلولی BD FACSymphony A3 با پنج لیزر و 28 دیتکتور فلوئورسانس تنظیم شده اند.

  شکل 1. شناسایی زیرمجموعه‌های DC در گردش در سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی انسان (MNCs). ابتدا بر اساس ویژگی‌های پراکندگی نور و سپس روی تک‌هسته‌ها (نشان داده نشده) قرار گرفتند. سلول های رده (CD3، CD56، CD19 مثبت ) از تجزیه و تحلیل حذف شدند. DCها بر روی جمعیت سلولی HLA-DR-CD14 منفی رده (LIN-) گیت شدند. از سلول های HLA-DR-CD14- (LIN-)، زیر مجموعه cDC1 با فنوتیپ -CD141-CD16 شناسایی شدند و نشان داده شد که Clec9A و CD26 را بیان می کنند. زیر مجموعه cDC2 از جمعیت -CD16-CD141 مشتق شد و با بیان مشترک نشانگرهای CD1c و CD11c شناسایی شدند. جمعیت cDC2 برای ارزیابی بیان سطح سلولی CD36 و CD172a/b (SIRPα/β1) بیشتر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. سلول های -CD16-CD141 به عنوان DC غیرکلاسیک علامت گذاری شدند که CD86 را بیان می کنند (در شکل نشان داده نشده است). 

شکل 2. شناسایی جمعیت AS DC و pDC در خون محیطی انسان
الف. DCها به دنبال استراتژی gating  که در شکل 1 توضیح داده شده است، شناسایی شدند. زیر مجموعه AS DC از سلول‌های -CD16-CD141 گیت شد و بر اساس بیان مشترک Axl و Siglec6 تعریف شدند. همانطور که نشان داده شده ، دو زیرمجموعه اصلی     CD11c- CD123high  و CD11c+ CD123low مشاهده شدند (Villani et al.2). جمعیت pDC از زیرمجموعه -Axl-Siglec6 دریافت گیت شد و با بیان مشترک  CD123 و CD303 شناسایی شدند.

 ب. کنترل‌های FMO برای Axl و Siglec6 نشان داده شده‌اند که از استراتژی دروازه‌ای که در شکل 2A توضیح داده شده است، پیروی می‌کنند.

شکل 3. بیان مارکر سطح سلولی در زیرمجموعه های DC انسانی.

هیستوگرام ها توزیع مارکر های سطح سلولی انتخابی را بر روی DC انسانی شناسایی شده با استفاده از پانل DC چند رنگ نشان می دهد. زیرمجموعه های DC در PBMC های اهداکننده سالم به دنبال استراتژی دروازه ای شناسایی شدند. بیان مارکر فنوتیپی برای زیرمجموعه های نماینده DC (CD16+ DC غیر کلاسیک، Axl+ Siglec6+ (AS) DC، cDC1، cDC2 و pDC) با overlay هیستوگرام نشان داده شدند.

شکل 4. تجزیه و تحلیل بدون نظارت داده های فلوسیتومتری برای بیان نشانگر DC.

 داده های به دست آمده در آنالایزر سلولی BD FACSymphony A3 توسط الگوریتم کاهش ابعاد UMAP (نرم افزار FlowJo) ارزیابی شد. سلول های HLA-DR–CD14 به دنبال گیتینگ دستی بر فلوسایتومتری شناسایی شدند و سپس از طریق پارامترهای تعریف شده پلاگین UMAP تجزیه و تحلیل شدند. آمار نقشه رنگی برای مارکرهای سطح سلولی منفرد نشان داده شده است. مقیاس رنگ شدت سیگنال مارکرها را نشان می دهد.

 

نتیجه

داده‌های ارائه‌شده در اینجا عملکرد یک پنل DC انسانی چندپارامتری 20 فلوئوروکرومی را نشان می‌دهد که روی آنالایزر سلولی BD FACSymphony A3 اجرا می‌شود. پانل آنتی بادی فلورسنت شناسایی زیرمجموعه‌های اصلی DC انسانی را میسر می‌کند، بیان مارکر ویژه زیرمجموعه دندریتیک را تأیید و برای آنالیز معمولی و بدون نظارت DCهای انسانی مناسب است. آنالایزر سلولی BD FACSymphony A3 انعطاف‌پذیری و وسعت را برای گنجاندن ترکیب 28 رنگ برای ایمونوفنوتایپ جمعیت سلول‌های ایمنی ارائه می‌دهد.

Reference
1. Jongbloed SL, Kassianos AJ, McDonald KJ, et al. Human CD141+ (BDCA-3)+ dendritic
cells (DCs) represent a unique myeloid DC subset that cross-presents necrotic cell
antigens. J Exp Med. 2010;207(6):1247-1260. doi:10.1084/jem.20092140

2. Villani AC, Satija R, Reynolds G, et al. Single-cell RNA-seq reveals new types
of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science.
2017;356(6335):eaah4573. doi:10.1126/science.aah4573

3. Collin M, Bigley V. Human dendritic cell subsets: an update. Immunology.
2018;154(1):3-20. doi:10.1111/imm.12888